• 發文/公布日期：2000-06-08
• 文件類別：法規
• 分類：藥品查驗登記
• 點閱次數：4019

主旨：

藥品非臨床試驗安全性規範

說明：

藥品非臨床試驗安全性規範 Guideline for the Noclinical Pharmacology/Toxicology Studies for Medicinal Products Application 第一章 新藥品許可上市之流程 新藥品 (指依據藥事法第七條之：新成份、新療效複方或新使用途徑之藥品) 上市許可之過程可分為三部份：(1) 進行臨床及非臨床試驗的安全、有效性測試；(2) 整理該藥品之實驗數據，提出申請進入人體臨床試驗 (Investigational New Drug，IND) 和新藥許可上市(New Drug Application，NDA)；(3) 衛生署審核IND 與NDA 之申請。雖然所有的新藥都經由上述的上市申請程序，但是每個藥品通過上市申請的過程及試驗的內容，包括臨床試驗與非臨床試驗之試驗形態與數量都不甚相同，須視每個新藥品的性質、劑型、用途、及給藥方式等情況而作調整。 一般新藥品必須經過一系列的非臨床試驗，測定其安全性及有效性，再進入人體臨床試驗。然而長期毒性試驗及臨床試驗非常費時，為使新藥品能早日嘉惠病患，及減少不必要的使用動物，非臨床與臨床試驗的時程可相互並行 (參見圖一之流程圖)，以短期毒性試驗之結果，援護初期的人體臨床試驗2。本新藥品上市許可之流程 (圖一) 適用於一般化學醫藥品開發，對於生物技術醫藥品的安全性評估之流程 (圖二)，則須依試驗物質特性而定。對於用作治療對生命有立即威脅疾病的藥物，則須依其裨益與風險的考量進行個案評估。 一、非臨床試驗1 所有新藥品進入人體臨床試驗之前，必須提供其安全性評估資料，包括：(1)非臨床動物試驗數據，可以推衍至此藥品實際產生的作用；(2) 臨床試驗數據或在其他國家的藥品使用情況證明。非臨床試驗包括藥理與毒性試驗。 1. 藥理試驗 a. 藥效學試驗 (Pharmacodynamic Study，PD) 藥效學試驗是評估藥物在主要器官 (心血管、中樞神經及呼吸系統) 的藥理作用、作用機轉、劑量和反應關係等之研究，試驗結果為此藥開發之依據。此項試驗須在人體臨床試驗前完成。 b. 藥動學試驗 (Pharmacokinetic Study，PK) 此項試驗係進行藥物之吸收、分佈、代謝、排泄方面的研究。藥物在進入人體試驗前須先進行動物試驗，所得的藥動數據，可作為第一期臨床試驗(人體藥理試驗)時，藥物在人體吸收、分佈、代謝、排泄過程的指引，以及作為臨床試驗與動物試驗結果之比較。 2. 毒性試驗 a. 單一劑量毒性試驗 單一劑量毒性試驗須先對至少兩種的哺乳類動物進行試驗，始可進行人體臨床試驗。哺乳類動物包含囓齒類及非囓齒類動物2，囓齒類動物一般最常使用大鼠和小鼠，近親、雜交或混合品系均可，但試驗動物須來自健康及特性鑑定完全之種源；非囓齒類動物一般最常使用狗，Beagles或其他純種品系狗均可。 b. 重覆劑量毒性試驗 重覆劑量毒性試驗的試驗週期須依該藥物將進入臨床試驗的那一個階段及給藥期間而定 (表一、二)。一般動物毒性試驗須進行兩種或以上的哺乳類動物，而試驗週期不得短於人體臨床試驗的週期。 表一、人體臨床試驗第一、二期與重覆劑量毒性試驗試驗週期對照表 臨床試驗試驗週期a 重覆劑量毒性試驗試驗週期 ≦ 2週 2週 ≦ 1個月 1個月 ≦ 3個月 3個月 ≦ 6個月 6個月 ＞ 6個月 6個月 a 某些狀況下，人體臨床試驗的試驗週期會依試驗需要延長，比重覆劑量毒性試驗的試驗週期長。 表二、人體臨床試驗第三期與重覆劑量毒性試驗試驗週期對照表 　　　　　　 臨床試驗試驗週期a 重覆劑量毒性試驗試驗期 ≦ 2週 1個月 ≦ 1個月 3個月 ＞ 1個月 6個月 a 某些狀況下，人體臨床試驗的試驗週期會依試驗需要延長，比重覆劑量毒性試驗的試驗週期長。 c. 局部容許劑量試驗 局部容許劑量試驗是以使用未來人體臨床使用的相同給藥途徑及部位進行給藥，觀察給藥部位的反應，評估其局部容許劑量，此試驗須在人體臨床試驗前完成。 d. 基因毒性試驗 在進行人體臨床試驗前，一般須以體外致突變性測試方法評估試驗物質對基因之突變與染色體之傷害情形，若試驗產生陽性反應，則須進行其他致突變性測試。標準的綜合基因毒性試驗則須在臨床試驗第二階段開始前完成。 e. 致癌性試驗 一般完整的致癌性試驗不需要在人體臨床試驗前進行，除非有其他因素考量。凡對於 (1) 未來須持續給藥6個月以上之藥品， (2) 過去之數據顯示此類別之藥品可能引起致癌性者， (3) 藥品之作用機轉推測可能有致癌性者， (4) 重覆劑量毒性之試驗結果顯示有腫瘤生成現象之藥品， (5) 藥品之成分或其代謝產物長期停留在組織中，產生局部的組織作用或病理生理反應，或 (6) 基因毒性試驗結果顯示有致突變性存在之藥品等，均應在藥物上市前完成致癌性測試。但是若試驗物質只針對有限的特定疾病或病患進行治療，且該試驗物質對病患的治療十分有效時，可視需要而在藥物獲准上市後進行。 f. 生殖與發育毒性試驗 生殖與發育毒性試驗應視給藥對象的需要而進行。若臨床試驗之受試者為男性和不具生育力之女性，而重覆劑量毒性試驗結果顯示該試驗物質對生殖器官不造成任何傷害，則生殖與發育毒性第一期試驗只須在臨床試驗第三階段開始前完成。具生育力之女性可參與尚未進行生殖毒性試驗之試驗物質的臨床試驗，但必須嚴謹、小心監控試驗過程，包括進行檢孕檢查、使用高效率之避孕方法及在確認的生理期後，方可進入臨床試驗，並須檢附受試者同意書，同意書須告知受試者該試驗物質可能潛在的危險性。 若第三階段臨床試驗包含使用高效率之避孕方法之具生育力女性，則生殖與發育毒性第一、二期試驗須在臨床試驗開始前完成，除非有其他因素考量，生殖與發育毒性第三期試驗可在藥物取得上市許可前完成。 若具生育力之女性不使用高效率之避孕方法或懷孕情況不明者，則生殖與發育毒性第二、三期試驗及基因毒性試驗須在臨床試驗開始前完成。 若懷孕之女性參與臨床試驗，該試驗物質須先完成生殖與發育及基因毒性試驗，方可進行臨床試驗。 g. 其他毒性試驗 若以上幾種毒性試驗結果顯示該試驗物質具有特定的毒性，則須進行其他特定的毒性試驗。 二、試驗中新藥之申請3 若非臨床試驗結果顯示新藥品的安全性已足以進行初步的臨床試驗時，則廠商可向衛生署提出試驗中新藥申請，經衛生署許可後方可進行人體臨床試驗。 提出試驗中新藥申請時，須至少具備以下兩項資料：(1) 所有非臨床試驗之藥理作用、藥物動力學、毒性、或安全性資料，及藥品之物理、化學性質、符合GMP規定之製造與品管步驟；(2) 臨床試驗計劃書：可證明藥品的人體臨床安全性與效用 (治療、預防或診斷) 之詳細臨床試驗計劃，同時檢附其他與臨床試驗有關的資料，如試驗主持人及主要協同人員之學、經歷及其所受訓練之背景等資料，及受試者同意書；(3) 人體試驗委員會同意函。 三、試驗用藥品使用許可之審核 (藥事法第五條) 衛生署對試驗用藥品之申請，依個案進行審查，決定藥品的安全性是否符合進行人體試驗的標準，同時檢查臨床試驗計劃書，以確保受試者之安全。經衛生署審核通過後，申請者即可開始進行臨床試驗。若審查過程中出現以下所述的情況，則不能進行臨床試驗： 1. 試驗用藥品之使用許可的申請資料中，並無足夠的資訊評估藥品臨床試驗的安全性。 2. 臨床試驗計畫書中所列的試驗主持人，其經驗及所受的訓練不足以執行臨床試驗之觀察。 3. 試驗主持人所依循之相關藥品的安全性與效用之資料有誤導、錯誤、或內容不齊全之情形。 四、臨床試驗4 臨床試驗是藥品發展的過程中最重要也是最困難的步驟，若藥品能夠通過臨床試驗，衛生署將根據這些臨床試驗結果決定是否核准該藥品的上市。衛生署對進行臨床試驗的藥品有較嚴格的標準，其規定為：(1) 藥品進行臨床試驗時，試驗主持人須為試驗用藥品使用許可申請書中所指定的人員；(2) 而臨床試驗步驟則須依臨床試驗計劃書中的方法進行；(3) 進行試驗的單位須符合藥品優良臨床試驗規範 (GCP) 的標準5，以保護病人的權益與保持臨床試驗數據的完整。臨床試驗一般分為三個階段進行： 第一階段： 對20~80名健康自願者給藥，以了解藥品在人體之吸收、分佈、代謝、排泄情形及安全性，確定人體忍受之劑量範圍，及可能引起的不良反應。 第二階段： 選擇至少100~200位自願病患進行，以了解該藥品可能之療效，並了解藥品在患者體內之吸收、分佈、代謝、排泄之情況，確定治療劑量及其治療範圍。 第三階段： 本階段在多重醫療中心或機構選擇足夠特定的患者，進一步確認藥品之療效，並藉由多數患者之治療，確定適應症，並偵測藥品禁忌、不良反應之發生情形，取得注意事項、藥品交互作用等之資料。 第四階段(新藥監視期)：針對核准上市之新藥品，為更了解其使用情形，於上市後列入售後監視，以了解藥品之不良反應發生情形、發掘罕見之不良反應，或了解是否有其他新適應症。 五、新藥上市許可之申請3 由於衛生署是根據新藥品上市申請所檢送的試驗數據決定藥品是否安全、有效而能上市，因此此步驟是藥品上市許可最重要的步驟。試驗單位或廠商須依其試驗數據提出藥品許可上市的申請。新藥品上市申請文件包含所有動物與臨床試驗的結果，詳細的藥品成分及其分析資料，藥品在製造、處理、包裝過程中的方法、設備、及條件，以及其他的相關資訊，如持續進行中的新臨床數據，以及最終定案的產品標示。 六、新藥上市許可的審核3 新藥上市的審核是對藥品進行更仔細的分析與審查。若在審查過程不利於藥品安全性與藥效的結果時，衛生署將由藥物審議委員會專家委員對廠商提出建議。衛生署對申請案做出決定後，須行文試驗單位及廠商告知申請案是否通過，若申請案未獲通過，會說明衛生署的決定，廠商如何改進可以有申覆的機會，但以一次為限。若申請案通過，則該藥品即可上市販售；若申請案須進行某些修正方可通過，則廠商須將修正過後的申請案交由衛生署再審核，以獲得正式的上市許可。 參考文獻 1. International Conference on Harmonisation Topic M3 Document. "Guideline for the Timing of Non-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals". (Step 3) 2. Siglin J.C. and Rutledge G.M. (1995). Laboratory Animal Management. In: CRC Handbook of Toxicology, pp1-50, Derelanko M.J. and Hollinger M.A. ed., CRC Press, Boca Raton. 3. Mathieu M. (1990). New Drug Development: A Regulatory Overview. Parexel Int. Co. Cambridge, USA. 4. 行政院衛生署(1994)。藥品臨床試驗申請須知。 5. 行政院衛生署(1997)。藥品優良臨床試驗規範。 圖一、新化學藥品上市流程圖 圖二、生物製劑上市流程圖 圖三新藥發展的過程 第二章 生物製劑之非臨床試驗規範 生物技術醫藥品的來源非常廣泛，且產品種類眾多，涵蓋由基因工程、細胞工程及蛋白質工程方法製造而得之藥品或檢驗試劑，基於生物製劑的多樣性，而生物活性亦隨結構的變化而改變，因此傳統的毒性測試方法不一定適用於此類產品，均採用較彈性的方式，依試驗物質特性而進行評估。 基於生物製劑的產品類型眾多，依據國際協調會議(ICH)之指導原則，本規範1 僅適用於基本的生物技術醫藥品，包括以細菌、酵母菌、昆蟲、植物及哺乳類動物細胞等製造的生物製劑，此類產品一般應用於醫學診斷、治療或預防，其有效成份包括經基因工程或細胞培養技術製造所得的蛋白質、胜月太 、及其衍生物等，如細胞激素(cytokines)、血纖維分解原酉每 活化劑(plasminogen activator)、基因重組的血漿蛋白及凝血因子(recombinant blood plasma factors)、生長激素(growth factor)、荷爾蒙(hormones) 與單株抗體(monoclonal antibodies) 等。本規範中部分內容亦適用於基因重組蛋白疫苗 (recombinant DNA protein vaccines)、合成胜月太 (chemically synthesized peptides)、由血漿中抽取的成份 (blood plasma extracted factors)、人體組織分離之內生性蛋白(endogenous proteins extracted from human tissue)、及寡核甘酸藥物 (oligonucleotide drugs)。對於細菌和病毒疫苗、基因疫苗、細胞和基因療法、抗生素、過敏性萃取物 (allergenic extracts)、肝燐脂、血球細胞成物(cellular blood component)、維生素、及微生物等產品，將依科技的發展及國際上管理的趨勢，依個案方式另行審核。 一、生物製劑的品質 生物製劑在生產及製造過程中可能因宿主細胞株 (細菌、酵母菌、昆蟲、植物及哺乳類細胞) 的來源被污染而造成危害，受污染之宿主細胞所製造之產品會引起過敏性反應或其他免疫病理效應。若生物製劑是利用昆蟲、植物或哺乳類細胞、或基因轉殖動物製造的，更應確定是否受病毒感染。因此生物製劑在製程過程中必須能除去或不活化這些病毒及其他不純物，以確保其安全性，並詳細鑑定產品中的成份，方可進入非臨床試驗。一般非臨床試驗與臨床試驗使用之產品須做比較，若產品的製造過程有所改變時，為確定產品在不同的製造過程中產品品質的一致性，可藉由產品的生化特性 (如性質、純度、穩定性、力價) 或藥動試驗來鑑定，同時評估此改變可能造成的影響。 二、非臨床試驗 一般非臨床試驗的目的為：(1) 決定人體臨床試驗的安全起始給與劑量及劑量增加之方式；(2) 測定試驗物質在標的器官中引起的毒性與其可逆性；(3) 決定臨床試驗的觀察檢測參數。基於生物製劑的多樣性，而生物活性亦隨結構的變化而改變，因此當傳統的毒性測試方法不適用於此類產品時，則可考慮採用較彈性的方式，依試驗物質特性而進行評估。 所有毒性試驗均需依循GLP規範進行，然而當生物技術藥品的測試系統，無法依循現行GLP規範時，則須說明是那些試驗，及其廠內 (In-House) 之GLP規範，作為產品安全性評估時之依據。 　　 1. 生物活性/藥效學試驗 生物製劑的活性可利用活體及體外測試方法獲得。體外試驗包括利用細胞株或初代細胞培養，檢驗試驗物質對細胞的反應與細胞增殖現象。由於某些生技藥品對動物品種有很高的專一性，因此須選擇適當的動物品種進行毒性試驗，而使用哺乳類動物細胞進行體外試驗有助預估生體之活性，例如測定受體的親和力、藥理作用，同時輔助選擇適當的動物品種進行活體藥理及毒性試驗。藉由活體試驗評估產品的藥理作用、作用機制，以利於評估試驗物質在臨床試驗中的作用。結合活體與體外試驗結果，有助於預測試驗物質在人體內可能產生的作用。對於單株抗體產品，抗體的免疫性質包括其抗原特性、補體結合、任何非預期的作用、及對非標的器官的細胞毒性等都須詳細敘述。 　　 2. 動物品種的選擇 由於生物製劑不同於一般藥品，其藥效活性具有品種或組織的特異性，因此標準毒性試驗使用的動物品種 (如鼠與狗) 在此並不一定適用，雖然一般藥品的安全性評估須使用至少二種哺乳類動物，某些情況下，可以考慮只進行一種動物試驗，但須提出說明。 一般進行毒性試驗的試驗動物，其產生的藥理須與人體相關，然而若體外非臨床試驗無法確定其相關的動物品種時，仍須進行一種動物的毒性試驗 (如14天以內的重覆劑量毒性試驗)，以評估此產品對主要器官功能 (如心血管、呼吸系統) 可能產生的毒性。 近年來已發展出與人體疾病型態相類似的動物，這些動物具有自發性疾病或帶著重組DNA分子 (基因轉殖動物)，提供良好的動物模式可進一步測定生技藥品的藥理反應、藥動性質及藥量，同時有助於測定此類產品的安全性。若能經由科學證明，具有特定疾病之動物亦可取代一般動物進行毒性試驗 [說明1]。 　　 3. 動物數量 動物的數目與性別須視實驗的需要做彈性的調整。每劑量組的試驗動物應足夠觀察出產品的毒性，若試驗動物數量太少，則只能觀察出產生毒性的機率，而無法觀察出其毒性的嚴重程度。若因試驗動物 (靈長類) 的數量有限時，則以提高觀察的頻率與期間來彌補此種限制。一般試驗須雄、雌兩性並用。 　　 4. 給藥途徑 非臨床試驗中使用的給藥途徑、給藥頻率及時間應盡量與臨床所用的相同，但須考量產品的藥動性質、生體可用率，及對試驗動物較安全與人道的劑量。若試驗物質的主成份溶解度較低、或試驗動物具較佳的藥物移除能力，可藉增加對試驗動物的給藥頻率，使試驗動物的給藥劑量與臨床使用劑量間相近。若由於生體可用率、動物品種 (生理性質、大小) 等限制而不能以臨床藥物給予途徑給藥，則可採用替代的給藥方式。 5. 劑量選擇 劑量須包含會產生毒性、能達到劑量反應，及不造成任何不良反應 (No Observed Adverse Effect Level，NOAEL) 的劑量。若試驗物質的毒性較低或不具毒性，無法確定最高劑量之極限，則須提出劑量選擇的依據，並應包含數倍於人體使用劑量的劑量。最高劑量之選擇應依據藥效與生理作用、試驗物質的取得及臨床使用情形。若動物細胞對試驗物質的親和性或效能比人體細胞低，則應進行更高劑量的試驗。每種生物製劑的安全劑量範圍及臨床應用均不盡相同，利用數倍於人體使用劑量的劑量有助於決定適當的安全劑量範圍及臨床應用。試驗動物給予試驗物質時，須考慮每種動物之每次最高耐受劑量，若超過動物本身負荷時，應分次適當給予，以達試驗之目的。 　　 6. 免疫活性 大多數生物製劑在動物活體中都具有免疫性，因此應在重覆劑量毒性試驗中測量抗體與該生物製劑結合的量，同時鑑定抗體反應的特性 (中和性或非中和性)，以了解其與藥動、藥效或毒性變化的關係。在數據分析時，須評估抗體生成對藥動或藥效參數、不良反應的發生與程度的影響，及抗體是否產生新的毒性。 不能只憑偵測到抗體而作為終止非臨床試驗或修改試驗的時間的標準，除非免疫反應能夠中和該生物製劑對動物活體的藥效或毒性作用。一般動物對不同基因工程蛋白的免疫反應不同 (人體亦然)，須評估因免疫補體等成份的形成或沈澱而導致的病理改變，並配合以上各項因素評估其安全性試驗的數據。 動物活體與人體對生物製劑產生抗體的反應並不相同，所以即使動物活體中產生明顯的抗體，人體卻不一定會有相同的反應。如以天竺鼠進行蛋白質產品的過敏性試驗通常會呈陽性反應，但此現象極少可能發生於人體。因此，評估免疫活性試驗結果時，須考量此試驗是否適合用來預測人體的反應。 三、毒性試驗 非臨床試驗的目的為在進行人體臨床試驗前及臨床應用時決定試驗物質的藥效與毒性效應，若生物製劑的結構及藥理作用，特別是藥動形態與市售品相似，則可減少毒性測試的項目。 　　 1. 安全藥理試驗 藉著適當的動物模式，觀察生物製劑在活體中產生任何非預期的藥理作用，並在毒性試驗或臨床試驗時觀察此藥理作用。安全藥理試驗可提供毒性的功能指標，這些功能指標可由獨立的試驗加以觀察，或在進行毒性試驗時加以觀察。安全藥理試驗的目的為鑑定主要生理系統的功能作用，可藉著離體器官或其他體外的測試系統，觀察生物製劑的藥理性質評估其對特定器官的功能的影響。 　　 2. 毒性與藥動學試驗(吸收、分佈、代謝、排泄，ADME))2 一般最常用的毒性與藥動學試驗為單一劑量藥動與組織分佈試驗，但生物製劑很難依一般的毒性與藥動學試驗規範進行，因此試驗並不能評估生物製劑在活體中之組織分佈、累積及排除情況。動物品種間ADME的差異對預測臨床現象的能力，及評估劑量與作用間之關係有很大的影響。藥動形態因免疫之清除機制作用的改變，將會影響ADME 形態與毒性數據的分析。ADME試驗所使用的試驗物質應足以代表使用於臨床的藥物，而給藥途徑亦須使用與臨床使用的相近。 a. 分析方法 視試驗需要並依科學方法決定使用的分析方法，一般而言，一種評估分析方法已足夠。若分析中有使用放射性標記的試驗物質，則須確定該放射性物質的活性與生物性質與原試驗物質相同。動物試驗與人體臨床試驗最好使用相同的分析方法，同時評估血漿與蛋白質或抗體對分析方法的影響。 b. 動物品種的選擇 使用與藥理及毒理試驗結果能相互比較，同時與人類相關的動物品種。 c. 吸收 觀察試驗物質的吸收與生體可用率的特性，以及其與給藥途徑的關係。吸收試驗可與毒性試驗一併進行，吸收形態會受試驗物質的配方或劑量的影響。在進行臨床試驗前，應先取得相關的動物吸收資訊，以決定安全劑量及給藥方式。 d. 分佈 組織分佈與清除機制之試驗有助了解試驗物質的藥理與毒性性質。由於放射性胺基酸追蹤劑會因蛋白質生成，而進入不相關的蛋白質或胜月太 中，因此使用具放射活性的胺基酸追蹤劑須小心控制。 e. 代謝 生物製劑的代謝途徑較傳統藥品簡單，因此動物品種間的代謝差異並無很大的影響。代謝形態的鑑定方法有很多，例如免疫化學偵測、色層分析、SDS-凝膠電泳分析等。 f. 排泄 生物製劑的排泄牽涉到不同的器官系統與作用機制，因此試驗須觀察各個器官的排泄速率。 3. 單一劑量毒性試驗 單一劑量毒性試驗至少使用一種的動物進行，觀察劑量與全身或局部毒性的關係，輔助選擇重覆劑量毒性試驗的劑量。同時可由藥理試驗或單一劑量毒性試驗觀察試驗物質之劑量與作用的關係。 　　 4. 重覆劑量毒性試驗 試驗應使用與臨床的給藥途徑及給藥頻率相同的方式。若試驗需要，試驗方法應包含觀察試驗物質的毒性動力學2。一般重覆劑量毒性試驗須測定試驗物質在復原期會否引起藥效或毒性增強作用，及遲發性的毒性作用。 重覆劑量毒性試驗的給藥週期須依藥品臨床使用的給藥週期及應用而定，一般生物製劑的給藥期間為1-3個月，若產品為短期使用 (七天以下)，或針對急性重大疾病，則兩週之試驗數據已足以提供藥品進行臨床及上市所須之資料。若產品是治療慢性疾病，則給藥期間為6個月。 　　 5. 免疫毒性 免疫毒性試驗包含免疫活性與過敏性評估。許多生物製劑會引發或抑制免疫系統。注射部位產生的感染反應可視為引發反應，同時，若動物產生自體免疫的現象，表示標的器官的表面抗原之表現有所改變，免疫毒性試驗可用以釐清這些現象。 　　 6. 生殖與發育毒性試驗 生殖與發育毒性試驗是依據生物製劑的性質、臨床應用及給藥對象來決定是否需要進行。若需要評估生殖與發育毒性，試驗內容與給藥頻率須依試驗動物品種特異性及抗原性修改 [說明2]。 7. 基因毒性試驗 一般基因毒性測試方法並不一定適用於生物製劑，因無法分析動物經投入大量的胜月太 /蛋白質物質而得的數據結果，同時生物製劑一般不會與DNA或其他染色體物質直接結合作用 [說明3]。但若有其他因素考量，如蛋白質產品含有有機連接物或外來DNA等成份，則須進行基因毒性試驗。 　　 8. 致癌性試驗 生物製劑須視臨床給藥的時間與給藥對象決定是否須進行致癌性評估，當囓齒類動物不是該產品評估毒性或免疫性的特定品種，一般傳統致癌性測試方法並不適用，則以其他試驗方法評估其致癌性。 生物製劑可能會引發細胞變型增殖或造成單株細胞大量增殖而產生腫瘤者可能情況下，應進行致癌性試驗，以評估該生物製劑是否刺激惡性細胞的形成、增殖或誘發惡性細胞在正常人體產生的生長能力。若由體外試驗發現生物製劑有誘發腫瘤之可能，則須對相關動物進行活體試驗。 若生物製劑在囓齒類動物活體中有生物活性且無免疫性，可考慮使用一種動物進行致癌性的評估。進行試驗時須小心選擇給藥劑量，可依據生物製劑的藥動學與藥效學試驗結果、受體的特性、及人體使用臨床劑量選擇最適當的劑量。 　　 9. 局部容許劑量試驗 一般欲上市生物製劑的配方須進行局部容許劑量測試，但若特殊情況，也可測試其代表性的配方。同時，生物製劑的局部反應可藉由單一劑量或重覆劑量毒性試驗所得之資訊進行評估。 說明 1. 利用具有疾病的動物模式進行試驗有助於決定毒性終點、選擇臨床劑量、並決定適當的處方，但此種試驗一般無相關試驗數據可作為評估試驗結果的參考，因此進行試驗時須同時收集對照與基線數據，以作為試驗的比較。 2. 若有充足的類似化合物之生殖與發育毒性資訊，而唯一相關的動物為靈長類動物，且反應機制試驗顯示新藥物會產生相似的作用，則可免除生殖與發育毒性試驗。 3. 生物製劑會在動物體內累積產生自發性突變細胞，可視為致癌物質，而標準的一般基因毒性試驗不適用於此類產品，則應以其他體外與活體試驗方法進行評估。 參考文獻 1. International Conference on Harmonization Topic S6 Document "Preclinical Testing of Biotechnology- Derived Product". (Step3) 2. International Conference on Harmonization (1995). Guideline on the Assessment of Systemic Exposure in Toxicity Studies 60(40):11264-11268 第三章 生物製劑之品質管制 生物技術醫藥品的來源非常廣泛，且產品種類眾多，涵蓋由基因工程、細胞工程及蛋白質工程方法製造而得之藥品或檢驗試劑，基於生物製劑在生產及製造過程中可能因宿主細胞株的來源被污染，使所製造之產品會引起過敏性反應或其他免疫病理效應，而造成毒害。若生物製劑是利用昆蟲、植物或哺乳類細胞、或基因轉殖動物製造的，更應確定是否受病毒感染。因此生物製劑在製程過程中必須能除去或消滅這些病毒及其他不純物，以確保其安全性，並詳細鑑定產品中的成份，方可進入非臨床試驗 (參見圖一)1。 生物製劑之製造過程因產品性質不同而改變，須依產品之特性進行品質管理及測試。生物製劑的絕對純度會因醣化作用 (glycosylation)、脫醯胺作用 (deamidation) 或其他異質性而難以測定，而這些變化會影響生物製劑之生物活性、穩定性、免疫毒性及安全性。一般生物製劑的性質可利用相關的物化、生化及免疫化學分析方法鑑定 [說明1]。 基因工程製劑及疫苗等以細胞成份生產的製劑，其製造管制須符合種源批次系統 (Seed Lot System) (表一)，種源批次系統的組成包括 (1) 種源細胞庫 (Master Cell Bank，MCB)，(2) 工作細胞庫 (Manufacture Working Cell Bank，MWCB)，(3) 最終產品細胞 (Maximum End-of-Production Cells，MEPC)2。 一、細胞株的鑑定2,3 基因工程蛋白質的製造須基於定義良好的種源細胞庫 (MCB) 與工作細胞庫 (MWCB) [說明2]。細胞株須經過無菌及黴漿菌 (mycoplasma) 之測試，細胞株之歷史及細胞庫的製造須詳細敘述，包括細胞培養方法與使用之試劑、體外細胞的代數與儲存條件，同時各細胞庫須標明其基因型 (genotype) 與表現型 (phenotype)，包括重組蛋白質的表現或重組基因載體構造的表現，並對MCB中的表現基因載體構造進行鑑定，若無法對MCB進行測試，則應對每個MWCB進行測試。種源細胞庫 (MCB) 表現結構之分析方法： 1. 使用Restriction endonulease mapping或其他適當的技術分析表現基因載體構造的複製數目，插入或刪除、及連結位置個數。對於extrachromosomal表現系統，則測定原有表現基因構造之宿主細胞所佔之百分比。 2. 確定表現基因載體構造之重組蛋白質的蛋白質序列 (protein coding sequence)。對於extrachromosomal表現系統，則分離表現基因載體構造並確定產品的核酸序列。對於具有表現基因載體構造之複製染色體細胞，可由複製染色體的再複殖與定序確定其核酸序列。 3. 生物製劑的核酸序列可以其他的技術加以確認，如sequencing of pooled c-DNA clones或polymerase chain reaction技術。 二、細胞庫及製程的污染測試4 一般由細胞株製造之生物製劑常會有受到病毒污染的危險，這樣的污染會在臨床上造成嚴重的後果，且污染可源自於來源細胞株或生產過程。因此在製造過程中須進行病毒偵測試驗，以確保所使用的細胞成份安全無虞，無有害的病源體污染。 1. 病毒來源 生物製劑的病毒污染可能源自於細胞株的來源，或在製造過程中引入病毒。 a. 內源性的病毒污染 細胞可能受潛伏或殘存的病毒感染，或由代代細胞垂直轉移的內源性反轉錄病毒感染，而這些病毒會以原性質呈現或呈現感染性病毒。MCB受病毒感染的途徑有：(1) 由受感染之動物的細胞株感染，(2) 使用含病毒細胞建立細胞株，(3) 使用受污染的生物試劑，及 (4) 細胞處理過程中被污染。 b. 外源性的病毒污染 外源性病毒可經由許多途徑介入最終產品：(1) 使用受污染的生物試劑，(2) 使用含病毒細胞所引發表現之蛋白質，(3) 使用受污染的試劑，如單株抗體親和層析凝膠，及 (4) 在配方過程中使用受污染的輔劑。 2. 病毒檢驗 (表二) a. 種源細胞庫 (MCB) 須對種源細胞庫進行廣泛的內源性 (endogenous) 與非內源性 (nonendogenous) 的病毒檢驗，由於人類或其他靈猿類動物之病毒污染會引起特別的傷害，因此須對異源融合細胞株進行測試，以偵測該病毒。 非內源性病毒測試須包括體外與活體接種測試及其他特定之測試，包括特定品種測試，如利用鼷鼠產生抗體 (mouse antibody production，MAP) 測試。若適用，根據細胞株過去之歷史偵測可能的病毒污染。 b. 工作細胞庫 (MWCB) 每一個生產用之MWCB或MEPC進行外源性病毒測試。若MCB及MEPC之細胞已進行非內源性病毒測試，則不須對MWCB進行類似的測試，但也可對MWCB進行完整的病毒測試。 c. 最終產品細胞 (MEPC) 最終產品細胞須進行內源性及外源性病毒測試一次以上，以確保製造過程未受病毒污染。若測得外源性病毒，則須詳細檢查製造過程，以查出污染的來源。 三、病毒鑑定4 偵測內源性及外源性病毒之分析方法非常多4，這些分析方法為目前所建議的方法，但並不完全侷限於此，須隨著科技之進步，及生物製劑之性質使用適當的分析方法。分析方法須包含對照組以確定其方法之靈敏度與專一性。若由細胞種類可預測某種特定的病毒之出現機率很大，則須針對該病毒進行偵測，如免疫缺陷及肝炎病毒。若用於生產之細胞株來源為人類或靈猿類動物，則須進行人體病毒之測試，如聚合酉每 連鎖反應 (polymerase chain reaction，PCR) 方法可偵測人體病毒及其他病毒的序列。 1. 反轉錄病毒測試 對於MCB或MEPC之細胞須進行反轉錄病毒測試，包括以敏感性細胞培養進行的感染性測試及電子顯微鏡試驗 (electron microscopy，EM)，若試驗結果並無測得感染性及在EM中並無觀察到反轉錄病毒或類似粒子，則需以反轉錄酉每 (reverse transcriptase，RT) 或其他適當的方法偵測不具感染性之反轉錄病毒。 2. 體外試驗 體外試驗之方法為將試驗物質接種在各種靈敏且可廣泛偵測人類或相關動物病毒的細胞培養中，測試細胞的選擇須依待測細胞庫的種類而定，但須包括對人體病毒敏感的人類或靈長類細胞株。測試方法及樣品須依病毒的種類而定，並偵測細胞病變及血球吸附病毒。 3. 活體試驗 活體試驗是將試驗物質接種於動物體內 (包括幼鼠、成鼠及受胎卵)，觀察無法在細胞培養中生長之病毒。依待測細胞株的性質與來源決定是否須對其他動物品種進行測試。試驗期間須觀察試驗動物之健康情況及異常現象，以了解發病的原因。 4. 抗體產生試驗 囓齒類細胞株之品種特定病毒可藉由將試驗物質接種至無病毒動物中，經過一段期間後，檢驗血清抗體濃度或酵素活性而測得，例如鼷鼠抗體產生測試法 (MAP)、大鼠抗體產生測試法 (RAP)、倉鼠抗體產生測試(HAP)。 說明 1. 一般生化分析方法包括：SDS PAGE (reduced and non-reduced)、HPLC reverse phase、size exclusion、ion exchange、amino acid analysis、protein sequencing、peptide mapping、isoelectric focusing、circular dichroism、mass spectrometry、carbohydrate analysis、biological activity、host cell proteins、nucleic acid、LAL、bioburden determination、sterility等。 2. (a) 種源細胞庫 (MCB) 是將相同成分的細胞於特定的條件下儲存，一般MCB為經挑選之含有表現基因載體的細胞株。 (b) 工作細胞庫 (MWCB) 是由MCB所衍生的細胞庫。 參考文獻 1. International Conference on Harmonization Topic S6 Document "Preclinical Testing of Biotechnology- Derived Product". (Step3) 2. FDA/CBER (1994). Draft Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use. 3. International Conference on Harmonization (1996). Final Guideline on Quality of Biotechnological Products: Analysis of the Expression Construct in Cells Used for Production of γ-DNA Derived Protein Products. Federal Register 61(37):7006-7008. 4. International Conference on Harmonization (1996). Guideline Availability: Biotechnological/Biological Pharmaceutical Products; Viral Safety Evaluation. Federal Register 61(92):21882-21891. 表一、種源批次系統的品質管制 MCB MWCB MEPC 無菌測試 ＋ ＋ ＋ 黴漿菌測試 ＋ ＋ ＋ 病毒測試 ＋ ＋ ＋ 動物品種專一性* ＋ － ＋ 反錄病毒測試** ＋ － ＋ 確定性測試 ＋ ＋ ＋ ＊ 若適用，測試囓齒類、靈長類或人類反錄病毒以外的病毒。 ** 除動物融合瘤外，其餘細胞物質均需進行反錄病毒測試。 表二 細胞種源批次之病毒測試 MCB MWCB MEPC 反轉錄病毒及內源性病毒檢測 感染性測試 ＋ 電子顯微鏡試驗a ＋a a 反轉錄酉每 b ＋b b 其他特定病毒測試c 若適用c － 若適用c 非內源性病毒檢測 體外測試方法 ＋ －d ＋ 活體測試方法 ＋ －d ＋ 抗體產生測試e ＋e 其他特定病毒測試f ＋f a 可同時測定其他作用物。 b 若反錄病毒感染測試為正反應，則不需進行。 c 適用於細胞株已知受該作用物感染。 d MWCB的首次細胞，使用由MCB所衍生之可使用的極限代數的細胞進行測試，由MWCB首次細胞所衍生之MWCB細胞，則只須對MWCB或其極限代數的細胞進行體外及活體測試。 e 如MAP, RAP, HAP - 一般適用於囓齒類細胞株。 f 測試由人類及靈長類來源之細胞株，若適用，可測試其他細胞株。 第四章 藥理試驗規範 (Guidelines for General Pharmacology Studies) 第1節 藥效學試驗 (Pharmacodynamic Studies，PD) 第2節 藥動學試驗 (Pharmacokinetics Studies, PK) 第四章 第１節 藥效學試驗 (Pharmacodynamic Studies, PD) 試驗物質的藥效作用可分為應用於治療標的疾病之主藥效作用及非標的疾病之一般藥效作用。一般藥效學試驗 (Pharmacodynamic study) 的目的為確定試驗物質其主藥效以外的其他藥效作用 (一般藥效作用)，試驗應能鑑定一般藥效作用，同時測定試驗物質的藥效，而試驗結果有助於預測試驗物質可能產生的不良反應，並提供處理該不良反應的相關資訊。此外，可藉由一般藥效學試驗偵測在毒性試驗無法偵測到的功能變化，並觀察任何不良反應。 因此，若在藥效學試驗中觀察到明顯的一般藥效作用時，則要對這些作用的反應機制加以探討。若在人體臨床試驗觀察到嚴重之不良反應，應藉一般藥效學試驗了解此不良反應的反應機制。 每個試驗物質的藥效作用都不相同，因此並無統一的測試步驟適用於一般藥效學試驗。本規範1 僅提供一般藥效學試驗的基本概念與測試方法，以應用於新藥之研發。 一般藥效學試驗的測試步驟可分為二部份，(1) 基本測試方法：所有新藥品須進行的藥效測試方法，試驗內容須能足以評估試驗物質可能產生的藥效作用，及 (2) 進階測試方法：根據基本測試方法之試驗結果而決定須進行的測試方法。 隨著科技的發展，應選擇最新穎的方法與技術進行一般藥效學試驗，同時參閱說明中一般目前常使用的試驗方法。 一、動物 1. 動物品種 選擇適於進行試驗的動物，如大鼠、小鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗等動物，此外動物的品種、性別、年齡等也須列入考量。 2. 測試系統 測試系統可分成下列四種： a. 活體動物 b. 離體的器官與組織 c. 血液與其組成份 d. 細胞與其組成份 3. 注意使用的試驗動物或測試系統的靈敏度、再現性及一般接受程度。 4. 使用的試驗動物與測試系統要能預測人體臨床試驗結果，將可提供有效資訊。 二、給藥 1. 給藥途徑 與未來人體臨床使用的給藥途徑相同，若試驗需要 (依測試系統之適用性) 可以其他給藥途徑取代。若試驗物質的吸收性很低，須改用其他給藥途徑，以能確定試驗物質完全吸收，如以靜脈注射給藥方式進行測試。 2. 給藥頻率 若以活體動物進行試驗，一般試驗物質是以單一劑量給藥，但若重覆劑量給藥會產生某些反應時，則選擇適當的給藥頻率進行試驗。 3. 劑量選擇 選擇劑量之基本考量要素： a. 試驗組之試驗物質給予劑量範圍須能觀察到劑量與藥效作用之間的關係。 b. 試驗組之試驗物質給予劑量範圍應足以涵蓋產生主藥效作用之劑量範圍。 若試驗物質的臨床使用的給藥途徑不是靜脈注射，使用之劑量須能使試驗物質的血中濃度高於產生主藥效作用的濃度。 4. 對照組 一般試驗須包含陰性 (溶劑) 對照組及/或陽性 (參考藥物或衍生藥物)對照組。 三、測試方法 1. 基本測試方法 評估試驗物質可能產生的一般藥效作用。 a. 一般活性與行為上的作用 肉眼觀察動物之一般活性，評估肉眼可觀察到的變化，以了解試驗物質的藥效作用 [說明1]。 b. 中樞神經系統的作用 (1) 檢查試驗物質對自發性活動力 (spontaneous locomotor activity) 的影響[說明2]。 (2) 評估一般麻醉作用 [說明3] 除了評估試驗物質對清醒的動物之麻醉作用外，亦須評估試驗物質對麻醉的動物產生的協力(synergistic)或拮抗(antagonistic) 作用。 (3) 評估試驗物質對痙攣的影響 [說明4] 除了評估試驗物質對活體動物的痙攣活性，亦須測試試驗物質對誘發痙攣的動物產生協力或拮抗作用。 (4) 評估鎮痛作用 [說明5] (5) 評估試驗物質對體溫的影響 c. 自律神經系統及平滑肌的作用 評估試驗物質對迴腸的作用，包括試驗物質本身產生的作用及與平滑肌興奮劑之交互作用 [說明6]。 d. 呼吸系統與心血管系統的影響 評估試驗物質對呼吸、血壓、血液流動、心率及心電圖的影響。一般使用麻醉中之動物進行試驗，若試驗需要也可使用清醒的動物。 e. 消化系統的影響 評估試驗物質對胃腸道蠕動的影響。觀察腸道蠕動之時間；若適用同時檢查使胃排空的時間 [說明7]。 f. 水與電解質代謝的作用 測定尿液的體積及尿液中鈉離子、鉀離子、氯離子等的濃度。 g. 其他重要的藥效作用 評估主藥效及上述作用以外的特別藥效作用，而此藥效作用在與試驗物質的化學結構或藥效相近的藥品得知可能產生的作用。 2. 進階測試方法 根據基本測試方法之試驗結果而決定須進行的測試方法，以期深入了解其藥效作用。 a. 中樞神經系統的作用 (1) 評估試驗物質對腦電波(electroencephalogram)的影響，可利用電腦輔助數據分析。 (2) 評估試驗物質對脊椎反應的影響。 (3) 評估試驗物質對條件下迴避反應(conditioned avoidance response)的影響。 (4) 評估試驗物質對運動協調能力與自發性活動力的影響 [說明8]。 b. 軀體神經系統的影響 (1) 評估試驗物質對神經與肌肉的界面合體之影響 [說明9]。 (2) 評估試驗物質對肌肉鬆弛之影響 [說明10]。 (3) 評估局部麻醉的作用 [說明11]。 c. 自主神經系統及平滑肌的作用 (1) 評估試驗物質對瞳孔大小及瞬膜收縮之影響。 (2) 利用離體的組織或器官，如血管、支氣管、輸精管、子宮等進行試驗。 d. 呼吸系統與心血管系統的影響 (1) 評估試驗物質因對自律神經性、誘發迷走神經性及頸動脈閉塞藥品等引起的血壓或心率變化的影響。 (2) 同時進行心臟檢驗。 (3) 利用離體的組織或器官，如心臟、心房、乳頭肌、血管等，評估試驗物質對該組織或器官的影響。 e. 消化系統的影響 (1) 評估試驗物質對胃液、唾液、膽汁、胰液分泌的影響。 (2) 利用體外試驗，評估試驗物質對胃腸道的蠕動力之影響。 (3) 利用活體試驗，評估試驗物質對胃腸道的蠕動力之影響。 (4) 評估試驗物質對胃與十二指腸的黏膜之影響。 f. 其他作用 (1) 評估試驗物質對血液凝固系統的影響 [說明12]。 (2) 評估試驗物質對血小板凝集的影響 [說明13]。 (3) 評估試驗物質對腎功能的影響 [說明14]。 (4) 評估溶血的可能性。 說明 1. 可使用多方觀察的方法。 2. 可使用評估自發性活動力的設備，如旋轉籠 (wheeling cage)、開放式廣場 (open field) 方法。 3. 一般麻醉可使用安眠劑，如巴比妥鹽酸 (barbiturate) 衍生物，若在此試驗模式觀察到試驗物質具有協力或拮抗作用，則要確定該作用是否作用於中樞神經系統。 4. 可以電擊或 pentylenetetrazol 引發痙攣，也可視試驗需要以 strychnine、picrotoxin、nicotine等引發痙攣。 5. 使用引發壓力的方法，或使用 writhing test、Randall-Selitto、hot plate、tail-flick等方法。 6. 使用適當的組織作用藥品，如histamine、acetylcholine、barium chloride、serotonin等。 7. 大鼠與小鼠的胃腸道蠕動時間，可以碳粉填充方法或其他生理測試儀器來評估。 8. 使用適當的方法，如rotarod測試法。 9. 適當的製備如坐骨神經-腓腸肌與橫隔膜神經-橫隔膜肌等離體組織模式。 10. 適當的方法包括收縮測試與heat drop方法。 11. 適當的方法包括角膜反射與皮膚反射的評估。 12. 測量包括血液凝固時間、加鈣後凝固時間 (recalcification coagulation)、及前凝血原酉每 凝血素 (prothrombin) 時間。 13. 測量包括ADP、膠原及花生油酸對血小板凝集的謗發。 14. 測量包括腎小球過濾速率 (glomerular filtration rate，GFR) 與腎臟血流量(renal plasma flow，RPF)。 參考文獻 1. JMHW (1995). Japanese Guidelines for Nonclinical Studies of Drugs Manual. 第四章 第２節 藥動學試驗 (Pharmacokinetic Studies, PK) 本規範1 以「藥動學試驗」 (Pharmacokinetic Studies) 名詞代表試驗物質之「吸收、分佈、代謝及排泄試驗」，藥動學試驗之目的是測定及了解試驗物質在動物活體內的吸收、分佈、代謝及排泄的過程，其不僅可用於預估該試驗物質之藥效、作用的過程與機轉，同時也可經由試驗物質在體內分佈、滯留期、濃度等數據而預估發生不良反應的可能性，作為選擇安全及有效的人體使用量之依據。 基於科學不斷進步，本規範期望以現階段的科學水準，並針對試驗物質的性質為準則，選擇適合於該試驗物質特性的測試方法，如化學性質、藥效、毒性、臨床反應及給藥途徑，進行藥動學試驗。 一、測試方法 1. 試驗物質 須對測試試驗物質、以同位素作標記 (isotope-labeled) 之測試試驗物質 [說明1]，及預期使用之劑型 (若試驗需要) 進行試驗評估。 2. 動物品種 以適合進行毒理試驗、藥理試驗、及藥動數據可沿用於臨床試驗的實驗動物為考量，選擇適當的動物品種2。 3. 給藥途徑 與未來臨床使用的給藥途徑相同，若試驗需要可以其他給藥途徑取代[說明2]。 4. 劑量範圍 參考毒理學試驗、藥理學試驗、及臨床試驗使用之藥量，選擇適當的劑量範圍2。 5. 給藥週期 原則上，單一及重覆給藥試驗均需進行。若進行重覆劑量給藥，則給藥週期與間隔須足以評估試驗物質在動物活體內的穩定度、累積程度及對藥物代謝酵素的影響。 6. 分析方法 清楚定義分析的方法及其靈敏度、準確度、專一性等性質。 二、觀測的參數 在評估試驗物質的藥動性質時，須觀察之參數如排除半衰期 (或任何其他相關的常數，如排除速率常數、平均停留時間等)、清除率、分佈的體積及生體可用率等，藉著觀察以上參數，可確定試驗物質是否具有線性藥動關係。若試驗需要，須檢驗該試驗物質之代謝產物的藥動性質。 1. 吸收 (Absorption) 此試驗的目的是了解試驗物質的吸收範圍及速率，可以藉由血液濃度與時間之曲線圖 (blood concentration vs time curve)，或血液濃度與排泄累積量之曲線圖 (blood concentration vs cumulative excretion) 測定 [說明3、4]。若試驗需要，則須檢測影響試驗物質吸收的因素 [說明5]。 2. 分佈 (Distribution) 此試驗的目的是檢驗試驗物質在不同器官與組織中的分佈情形，以及試驗物質之累積程度隨時間而產生的變化 [說明6]。須檢驗之項目包括： a. 試驗物質在組織與器官的濃度3 [說明7]。 b. 藉由動物全身的自體射線攝影術 (autoradiography) 觀察分佈之情形。 c. 試驗物質移轉到胎盤和胎兒的情形。 d. 與血漿蛋白質結合 (plasma protein binding) 及分佈於血液中的量。 3. 代謝 (Metabolism) 代謝試驗的目的是鑑定試驗物質及其代謝產物，並進行定量，同時測定試驗物質的代謝途徑、程度、與速率，了解試驗物質在試驗動物與人體的代謝過程之異同處。代謝試驗一般自生物檢體 (如血液、尿液、膽汁與糞便) 中分離出試驗物質或其代謝產物，進行定量 [說明8]。若試驗需要，則須檢測影響試驗物質代謝的因素 [說明9]。 4. 排泄 (Excretion) 排泄試驗的目的是在確定試驗物質及其主要代謝產物的排泄途徑、程度、與速率 [說明10]。若試驗需要，則須檢測影響試驗物質排泄的因素 [說明11]。排泄途徑之檢測包括： a. 尿液、糞便、呼氣 [說明12]。 b. 膽汁 [說明13]。 c. 乳液。 5. 其他的評估及考慮項目 觀察試驗物質對藥物代謝酵素系統的影響，若試驗需要，則須觀察及評估藥物交互作用與初度作用 (first-pass effect) [說明14]。若試驗物質為消旋混合物，則須檢驗每個光學異構物之藥動性質。 說明 1. 使用同位素標記的化合物，須註明：供應者、合成方法、純度、使用的同位素、標記的位置、特定放射活性、穩定性等相關資料。 2. 若以靜脈注射或其他途徑給藥，可不須考慮試驗物質吸收的過程，只須提供基本藥動數據，了解試驗物質的藥動性質。 3. 血中濃度之數據包括自血清、血漿或全血所測得。試驗物質的吸收程度及速率可藉由測定試驗物質及其代謝產物在血中最高濃度 (Cmax)、到達該濃度所須的時間 (Tmax) 及血中濃度對時間所作曲線下的面積 (the area under the blood concentration curve，AUC) 等參數而得。若以給藥途徑與靜脈注射或其他標準給藥途徑方式給藥的參數結果進行比較，可更精確地預估試驗物質吸收的範圍與速率。 4. 排泄之數據包括測量試驗物質在糞便、尿液、膽汁、呼氣中的排泄量，這些總排泄量可作為試驗物質吸收程度的指標。 5. 下列因素會影響試驗物質吸收： a. 試驗物質在腸胃道中之溶解度。 b. 在製備過程中試驗物質被釋出的情形。 c. 吸收部位。 d. 試驗物質在腸胃道內之代謝程度及穩定度，若試驗物質是經由胃腸道以外部位給藥，則觀察試驗物質在給藥部位的代謝程度與穩定性。 e. 腸胃道內之食物及酸鹼值。 6. 進行試驗時，要有足夠的觀測時間點，以反應試驗物質的藥動性質。 7. 此試驗在單一劑量試驗後進行，若發現試驗物質在器官與組織之濃度很高或呈現蓄積的現象，此時須進行重覆劑量組織分佈試驗，並須測定分佈在器官與組織中之化學成份，以了解試驗物質的毒性與藥效，並評估試驗物質的累積程度與血中濃度之關係。 8. 除了活體試驗，以試驗物質之代謝器官的部分細胞、細胞懸浮物及組織均質物 (tissue homogenate) 而得之樣品進行體外試驗，亦有助於了解試驗物質的代謝情形。 9. 代謝過程會因動物品種、年齡、性別、疾病症狀等因素而改變，亦可能因重覆給予試驗物質或同時給予多種試驗物質造成的酵素被誘發或抑制而改變。代謝過程會因不同劑量與給藥速率而呈非線性現象，而試驗物質的非線性代謝現象與給藥途徑會影響到試驗物質與其代謝產物的比例，及代謝型態。 10. 試驗物質的排泄累積量與給藥劑量之比值，可作為累積程度與藥動學試驗可信度的參考指標。 11. 下列因素會影響試驗物質之排泄：如 (1) 腎功能；(2) 尿液酸鹼值；(3) 尿流速率。 12. 放射性物質經單一劑量給藥後，須測量至排泄物的放射性總量達給藥量的 95%，或至給藥後第七天止，選用所需時間較短的一種測試方法進行。 13. 若試驗物質主要排泄至膽汁中，須觀察試驗物質或其代謝產物是否參與腸肝 (entro-hepatic) 循環。 14. 若試驗物質會影響藥物之代謝酵素，或試驗物質具高蛋白結合率，則有可能產生藥物交互作用。而若試驗物質以口服或其他途徑給予，在通過肝臟迅速被代謝並排泄至膽汁中，則表示此物質有明顯first-pass effect作用。 參考文獻 1. JMHW (1995). Japanese Guidelines for Nonclinical Studies of Drugs Manual. 2. International Conference on Harmonization (1995). Guideline on the Assessment of Systemic Exposure in Toxicity Studies 60(40):11264-11268. 3. International Conference on Harmonization (1995). Guideline on Repeated Dose Tissue Distribution Studies 60(40):11274-11275. 第五章 毒性試驗規範 (Guidelines for Toxicity Studies) 第1節 單一劑量毒性試驗 (Single Dose Toxicity Study) 第2節 重覆劑量毒性試驗 (Repeated Dose Toxicity Study) 第3節 基因毒性試驗 (Genotoxicity Study) 第4節 生殖與發育毒性試驗 (Reproductive and Development Toxicity Study) 第5節 致癌性試驗 (Carcinogenicity Study) 第6節 皮膚過敏性試驗 (Skin Sensitization Study) 第7節 皮膚感光過敏性試驗 (Skin Photosensitization Study) 第8節 皮膚刺激性試驗 (Skin Irritation Study) 第9節 眼睛刺激性試驗 (Eye Irritation Study) 第五章 第１節 單一劑量毒性試驗 (Single Dose Toxicity Study) 單一劑量毒性試驗1 的目的為測試試驗物質經單一劑量給藥後 (包含24小時內完成的多次給藥)，對哺乳類動物之急性毒性影響，包括檢測其在活體中毒理特性之量與質的任何改變，此試驗結果有助於重覆劑量毒性試驗時劑量範圍之選擇，同時可顯示該試驗物質的標的器官與遲發之毒性。同時單一劑量毒性試驗可協助選擇臨床試驗第一階段的起始劑量，並了解服藥過量可能引發之急性毒性。 一、動物品種 使用至少兩種的哺乳類動物，一種為囓齒類 (最常用的為大鼠、鼷鼠)，另一種為非囓齒類動物 [說明1]，兔子除外。其中至少一種的動物須包含雄、雌兩性。 二、動物數量 囓齒類動物每個劑量組使用10隻 (5雄、5雌) 或以上動物；非囓齒類每個劑量組使用6隻 (3雄、3雌) 或以上動物。 三、給藥途徑 進行兩種或以上的給藥途徑；(1) 與未來人體臨床使用之給藥途徑相同，(2) 會引起全身性作用的給藥途徑，若試驗物質許可，使用靜脈注射途徑給藥。若靜脈注射是未來人體臨床使用之給藥途徑，則不須進行其他給藥途徑 [說明2 ]。 四、劑量範圍 劑量範圍須包含不會產生不良反應及足以顯示毒性症狀 (造成死亡) 之劑量。此外，還要包括溶劑對照組、及/或空白對照組。若試驗物質毒性很低，則以試驗物質許可之最高限界劑量進行 [說明3 ]。 五、觀察 1. 一般試驗觀察期為14天，每天至少觀察動物二次，以確定死亡情形。 2. 每天至少觀察試驗動物的症狀一次，記錄試驗動物顯示的毒性症狀，包括死亡率、臨床毒性症狀 (嚴重程度)、發生時間、持續的時間及中毒後的復原性，並瞭解毒性症狀與劑量及時間的關係。 3. 在觀察期間死亡的動物 (囓齒類或非囓齒類動物) 及試驗終結存活的囓齒類動物均須進行屍體解剖和肉眼病理檢查。 4. 若試驗需要，所有肉眼可觀察到有病變的器官與組織均須進行組織病理檢驗。 說明 1. 若具有初步單一劑量毒性試驗或短期重覆劑量毒性試驗的試驗結果，且其劑量範圍及臨床觀察已被確定，則可刪除非囓齒類動物的單一劑量毒性試驗。 2. 囓齒類動物，口服給藥若採強迫餵食的方式，給藥前動物須經過特定時段的禁食，而給藥之體積應在10 ml/kg動物體重以下，若給藥體積過高，可採多次給藥方式，但須在6小時內完成。 3. 若試驗許可，依不同劑量所產生的死亡率或毒性症狀估算致死劑量。 參考文獻 1. Federal Register (1996). Single Dose Acute Toxicity Testing for Pharmaceuticals. Federal Register 61(166):43933-43935. 第五章 第２節 重覆劑量毒性試驗 (Repeated Dose Toxicity Study) 重覆劑量毒性試驗之目的是測試試驗物質經重覆給藥後對哺乳類動物可能產生之毒性影響，了解毒性變化之產生，同時測定無毒性顯示之劑量。給藥時間的長短，依照試驗物質在未來臨床使用之頻率，選擇毒性試驗的給藥期間1，一週給藥7天 [說明1]。 藥物於臨床上使用之期間 毒性試驗 給藥期間 單一劑量 亞急性 2~4週 二週以下的重覆劑量給藥 亞急性 1個月 一個月以下的重覆劑量給藥 亞慢性 3個月 [說明2] 一個月以上的長期重覆劑量給藥 慢性 6個月 [說明2] 產生特殊毒性性質的試驗物質[說明3] 慢性 6個月[說明2、4] 一、動物品種 使用至少兩種的哺乳類動物，一種為囓齒類，另一種為非囓齒類動物 (兔子除外)，最常使用的動物為鼠和狗。 二、性別 雄、雌兩性動物的數量須相同。 三、動物數量2 1. 亞急性毒性試驗：囓齒類動物每個劑量組使用雄、雌各10隻或以上動物；非囓齒類每個劑量組使用雄、雌各4隻或以上動物。若須進行試驗中期解剖或復原測試，動物數量須視解剖的次數適量增加，而每次試驗中期解剖，每組雄、雌各10隻或以上。 2. 亞慢性毒性試驗：囓齒類動物每個劑量組使用雄、雌各20隻或以上動物；非囓齒類每個劑量組使用雄、雌各4隻或以上動物。若須進行試驗中期解剖或復原測試，動物數量須視解剖的次數適量增加，而每次試驗中期解剖，每組雄、雌各10隻或以上。 3. 慢性毒性試驗：囓齒類動物每個劑量組使用雄、雌各20隻或以上動物；非囓齒類每個劑量組使用雄、雌各4隻或以上動物。若須進行試驗中期解剖或復原測試，動物數量須視解剖的次數適量增加，而每次試驗中期解剖，每組雄、雌各10隻或以上。 四、給藥途徑 與未來人體臨床使用的給藥途徑相同 [說明5]。 五、劑量範圍 為了使毒性試驗能夠顯示試驗物質的毒性影響，並了解劑量與毒性間的關係。試驗中至少要有三個劑量組：(1) 高劑量為該劑量足以使試驗動物產生毒性症狀，但不造成死亡；(2) 低劑量為不會引起毒性的劑量；(3) 中間劑量為足以引起最低毒性作用 (如血中酵素值改變或體重成長速度下降)。此外，還要包括載體對照組、空白對照組，若試驗需要可加入參考對照組。 六、觀察與檢驗2 1.觀察 a. 每天至少觀察動物二次，以確定死亡情形。 b. 每天至少觀察試驗動物的症狀一次，記錄試驗動物顯示的毒性及藥效作用，包括作用之開始及過程。若發現腫瘤生長，則記錄每個肉眼可觀察到或觸摸到的腫瘤發現時間、部位、大小、外觀及成長過程。在亞急、亞慢性毒性試驗，須同時觀察動物行為的改變、自主官能管制失調、及其他神經系統毒性徵象。 2. 體重與食物消耗量 定期測量動物的體重及食物消耗量。若試驗需要，須同時測量動物的飲水消耗量。 a. 體重：試驗開始給藥前，測量動物體重；給藥期間每週至少測量一次。 b. 食物消耗量：試驗開始給藥前，測量食物消耗量；給藥期間每週至少測量一次。囓齒類動物食物消耗量之測量可以每隻或每組為單位[說明6]。 3.病理檢驗 a. 血液檢驗 (Hematology) 試驗動物須在開始給藥前、給藥期間 (若試驗需要) 及解剖前各採樣一次，以進行血液檢驗，一般而言全部動物均須進行血液檢驗，但可因實際情形考量，囓齒類動物每個劑量組選擇雄、雌各10隻或以上動物進行檢測。血液檢驗項目愈多愈好 [說明7]，視試驗需要而定。 b. 血清生化檢驗 (Clinical Chemistry) 試驗動物須在開始給藥前、給藥期間 (若試驗需要) 及解剖前各採樣一次以進行血清生化檢驗。動物進行血液採樣前，須經過禁食 (8小時以上)。一般而言全部動物均須進行血清生化檢驗，但可因實際情形考量，囓齒類動物每個劑量組選擇雄、雌各10隻動物或以上進行檢測。血清生化檢驗項目包括電解質的平衡、醣類的代謝、及肝與腎功能等 [說明8]。 c. 尿液分析 (Urinalysis) 視試驗需要進行。囓齒類動物，每個劑量組選擇雄、雌各10隻動物或以上在給藥期間至少進行尿液分析一次；而非囓齒類動物，則所有的試驗動物在試驗開始給藥前及給藥期間至少進行尿液分析一次 [說明9]。 d. 眼科檢查 (Ophthalmological examination) 囓齒類動物，最高劑量組及對照組的動物在試驗開始、給藥期間 (若試驗需要) 及試驗結束時至少進行一次的眼科檢查。若發現眼睛的改變是因試驗物質引起，則在此次及其後定期檢查時，全部動物均須進行眼科檢查；而非囓齒類動物，則所有的試驗動物在試驗開始、給藥期間 (若試驗需要) 及試驗結束時至少進行一次的眼睛檢查 [說明10]。 e. 其他測試 若試驗需要，可進行免疫毒性、EKG、視力、聽力及腎功能等測試。 4. 組織病理檢驗 [說明11] a. 試驗期間死亡的動物須儘快進行解剖，肉眼檢查器官與組織之變化。若許可，主要臟器分別稱重並進行組織病理檢查，以找出死亡的原因及毒性變化的性質 (如嚴重程度)。 b. 為了獲得更充足的毒性資訊，垂死的動物均行安樂死。動物在處死之前須記錄臨床觀察之結果，若許可，收集血液樣品以進行血液及血清生化分析。動物進行屍體解剖，以肉眼觀察其器官與組織並進行組織病理檢驗，以了解毒性變化的性質 (嚴重程度)，若試驗需要，記錄主要臟器的重量。 c. 試驗結束 (給藥期或復原期)，全部存活的動物行安樂死後，在剖檢前先收集血液樣品，以進行血液與血清生化分析。屍體解剖時，觀察及記錄動物的器官與組織之肉眼變化，並測量主要臟器重量。非囓齒類動物，全部動物之器官與組織須進行組織病理檢驗，而囓齒類動物則最高劑量組與對照組須進行組織病理檢驗，若最高劑量組中某種器官及/或織發現病變現象，則全部動物的該器官及/或組織，及其他劑量組中發現任何組織變化的組織，進行組織病理檢驗。在慢性毒性試驗，中、低劑量組動物之主要器官 (肺、肝及腎臟) 亦須同時進行組織病理檢驗。 5. 復原試驗 為瞭解毒性變化的可逆性，可考慮在試驗中加入復原試驗組。 說明 1. 若以胃管給藥，每週至少給藥5天。 2. 若重覆劑量毒性試驗之試驗期為三個月或以上，在試驗前須先進行一個月的短期重覆劑量毒性試驗。此短期試驗可為長期毒性試驗決定適當的劑量範圍，同時可了解該試驗物質的早期毒性變化，配合長期毒性試驗的結果，可了解該試驗物質的毒性影響。 3. 若試驗物質在活體中會產生大量的累積，長期的給與試驗物質會造成不可復原的毒性或毒性明顯地增強。 4. 非囓齒類動物的試驗期為12個月。 5. 口服給藥若以胃管給藥時，給藥之體積應在10 ml/kg動物體重以下，若給藥體積過高，可採多次給藥方式，但須在6小時內完成。 6. 若試驗物質是以混入飼料或飲用水的方式給藥，則須以每隻或每組為單位，定期測量飲食或飲水的消耗量，同時測量食物的掉落量，換算成實際的試驗物質消耗量。在試驗開始前及在適當時機進行試驗物質之穩定性與純度的量與質之測量。 7. 血液檢測項目：hematocrit、hemoglobin、erythrocyte count、total and differential leukocyte counts 及凝血因子 (clotting time、prothrombin time、activated partial thromboplastin time 或 platelet count) 等之測量。 8. 血清生化檢測項目： a. 血清生化檢測項目包含 alanine aminotransferase、albumin、alkaline phosphatase、aspartate aminotransferase、bilirubin (total)、calcium、chloride、creatinine、